» » » Курсовая работа: Витальный метод изучения половых клеток животных

Курсовая работа: Витальный метод изучения половых клеток животных

Курсовая работа: Витальный метод изучения половых клеток животных казакша Курсовая работа: Витальный метод изучения половых клеток животных на казахском языке
Содержание
Аннотация....................................................................................................................2
Нормативные ссылки..................................................................................................3
Определения................................................................................................................4
Обозначения и сокращения........................................................................................5
Введение ......................................................................................................................6
1. Витальный метод изучения репродуктивных клеток животных........................8
2. Извлечение эмбрионов..........................................................................................15
2.1. Хранение эмбрионов..........................................................................................16
3. Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного....................................18
3.1. Капацитация сперматозоидов............................................................................21
3.2. Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий
развития эмбрионов...................................................................................................23
Техника безопасности ..............................................................................................25
Заключение ................................................................................................................26
Список использованной литературы........................................................................27

Введение
Биология – это наука, которая в наши дни активно развивается и огромные надежды возлагаются именно на биотехнологии. Сейчас методы биотехнологии внедряются в промышленность, сельское хозяйство и медицину. Генетическая инженерия, клеточная инженерия и конечно клонирование наиболее актуальны в XXI веке и к сожалению в школе не в полной мере рассматривают эти темы. Я выбрал именно эту тему для своей работы так как хочется узнать больше о направлениях современной биологии.
Биотехнология, использование живых организмов и биологических процессов в промышленном производстве. Развивается микробиологический синтез ферментов, витаминов, аминокислот, антибиотиков и т.п. Перспективно промышленное получение других биологически активных веществ (гормональных препаратов, соединений, стимулирующих иммунитет, и т.п.) с помощью методов генетической инженерии и культуры животных и растительных клеток.
Биотехнология (от греч. bios — жизнь, techne — искусство, мастерство и logos — слово, учение), использование живых организмов и биологических процессов в производстве. Биотехнология — междисциплинарная область, возникшая на стыке биологических, химических и технических наук. С развитием биотехнологии связывают решение глобальных проблем человечества — ликвидацию нехватки продовольствия, энергии, минеральных ресурсов, улучшение состояния здравоохранения и качества окружающей среды.
Скорость генетического улучшения, которая может быть достигнута в пле¬менных программах повышения воспроизводительной способности живот-ных, имеет в настоящее время большое теоретическое и практическое зна-чение.
В данное время возникает острая потребность изучения вопросов физи-ологии генетической изменчивости и биологических критериев воспроиз-водительных качеств у животных. Это сравнительно новое и быстро разви-вающееся направление в Генетике и биотехнологии животных. Выявление признаков, по которым можно предсказать генотип у животных по физиоло-гическим параметрам представляет большой научный интерес. Понимание механизма, контролирующего рост, развитие и созревание овулирующих фолликулов, оплодотворение гамет и эмбриональное развитие плода, мог¬ло бы способствовать выявлению селекционных критериев генетического улучшения воспроизведения, что очень ценно для разработки новых приемов наследственно обусловленного повышения плодовитости животных. Селек-ционные аспекты разведения во многом определяются процессами, способ-ствующими регулированию биологических качеств животных. И не секрет, что одним из основных путей регулирования этих процессов является био-технология.
В основу методов биотехнологии легли теоретические разработки по ис-кусственному осеменению, гормональному регулированию воспроизводи-тельной функции, трансплантации эмбрионов у животных. Перспективы ис-пользования методов биотехнологии в практике разведения животных столь грандиозны, что уже сегодня в ряде стран эти исследования поставлены на коммерческую основу В зоотехнии по биотехнологии животных в данном направлении сделан огромный прогресс
«Биотехнология животных» состоит из четырех частей: основы лабораторного дела, эмбриотрансплантации, эмбриокультуры и эмбриоинженерии.
1. Витальный метод изучения репродуктивных клеток животных
Витальный метод изучения репродуктивных клеток и эмбрионов живот-ных основан на исследовании живой клетки. Для использования витального метода исследования репродуктивных клеток животных необходимо нали¬чие питательной среды и микроскопа.
Питательная среда. После извлечения из репродуктивного тракта гаме¬ты и эмбрионы помещаются в питательную среду (в «культуру»). При этом питательная среда должна полностью обеспечивать все внешние условия, которые имелись при условиях in vivo, так как только в этом случае возможно сохранение их жизнедеятельности, обеспечение факторов для созревания гамет, их оплодотворения и дальнейшего эмбрионального развития.
Ингредиенты, входящие в состав сбалансированного солевого раствора Эрла для культивирования эмбрионов и ооцитов in vitro
Состав Характеристика
EBS Сбалансированный солевой раствор Эрла, в 10 - кратной концентрации, без бикарбоната натрия
Вода Дистиллированная
Бикарбонат натрия В виде раствора
Пируват натрия Основной раствор 1,1 мг/мл
Пенициллин 600 мг/мл
Гентамицин 10 мг/мл
Гепарин 0,2 мл, содержащие 5000 ME.
БСА -
HEPES 5,96 г/100 мл
Среда, обеспечивающая рост и развитие биологических систем благодаря наличию в своем составе компонентов, необходимых для нормальной жизнедея¬тельности клеток, называется питательной (культуральной). По химическому со¬ставу питательная среда, в среднем, состоит из 80-90% воды, 10-15% белка, 2% липидов, 1% углеводов, 1% нуклеопротеидов, 1 -1,5% неорганических веществ.
Основными требованиями при подготовке питательных сред являются растворимость компонентов, отсутствие токсичности и стабильность. При эмбриокультуральных исследованиях в животноводстве питательная среда выполняет следующие важные функции:
1. Обеспечивает питательными веществами, гормональными фактора¬ми развития, ферментами, витаминами, транспортными белками, липидами, минеральными компонентами, так как они все в комплексе необходимы для нормальной жизнедеятельности клеток.
2. Создает физико-химические условия для полноценного развития (рН, осмолярность).
Среды можно приобрести в готовом виде. Выпускаются они в жидком виде (в десятикратной концентрации), или в форме порошка (EBS, F10). Од-нако многие исследователи готовят среды самостоятельно, поскольку это дает возможность контролировать каждый ингредиент.
Среда для промывания фолликулов и работы с эмбрионами
Состав Процедура
А. Для приготовления 400 мл EBS, забуференного HEPES без антибиотика
Пируват натрия 1,1 мг/мл
1 Бикарбонат натрия 0,1348 г растворить в 20 мл волы
EBS В 295 мл воды добавить 40 мл EBS, 1.1 мг/мл пиру-вата натрия; затем медленно (для предотвращения образования осадков) пипеткой добавить раствор бикарбоната натрия, осторожно встряхивая. Полу¬ченный раствор должен быть прозрачным.
HEPES Ввести 33,6 мл
Проверить режим полученной среды: осмолярностъ, рН, t.
В. Среда для получения ооциток
Гепарин 350 мкл гепарина добавить к 3S0 мл EBS. забуференного HEPES. Стерилизовать миллипоровой фильтрацией.
С. Приготовление среды для переноса эмбрионов
Сыворотка 2 мл инактивированной нагреванием сыворотки добавить к 18мл HEPES. Стерилизовать фильтраци¬ей.
В лабораторных условиях питательные среды готовят в 1 -литровом объеме. При этом ингредиенты растворяют примерно в 700 - 800 мл воды. Соли раство¬ряют в той последовательности, что приведено в рецепте. После окончания про¬цедур, связанных с растворением ингредиентов, объем раствора доводят до 1л и, после чего, проводят его стерилизацию под давлением через миллипоровые фильтры или автоклавированием (1 атм, t =1150С; в течение 20 - 35 мин.). После охлаждения через раствор бикарбоната натрия пропускают СО2. Сыворотка, бел¬ковые добавки (например, инсулин и др. гормоны) хранятся при температуре минус 200С и добавляются непосредственно перед использованием.
В зависимости от химического состава различают три категории сред:
1. Среды с сывороточными добавками. Клетки выращиваются в основном среде содержащей небольшое количество сыворотки и обобщенной сывороточными добавками.
2. Среды с заменителями сыворотки. Клетки выращиваются в основной среде, в которую добавлены определенные заменители сыворотки.
3. Бессывороточные, которые, в свою очередь, подразделяются на три подгруппы:
а) простые (белки отсутствуют);
б) специальные (содержат очищенные бел¬ки, гормоны, ферменты, витамины);
с) неопределенные (экспериментальные среды, в составе которых имеются "неопределенные" биологические добавки).
Среда для оплодотворения in vitro
Ингредиент Процедура
А. Для получения 100 мл исходного раствора EBS. забуференного бикарбонатом
Пируват натрия Основной раствор 1,1 мг/мл
Бикарбонат натрия 0,21 г растворить в 10 мл волы
EBS К 10 мл десятикратного раствора добавить 77 мл воды, пируват натрия: после чего медленно внести с помощью пипетки раствор бикарбоната натрия, осторожно встряхивая (важное условие - раствор должен получиться прозрачным)
Антибиотики Добавить 10 мкл раствора пенициллина и 0,2 мл раствора гентамицина
В. Приготовление среды для оплодотворения in vitro
БСА 0,4 г + 80 мл EBS и оставить для естест¬венного постепенного растворения. Профильтровать через миллипоровые фильтры.
Среда для культивирования эмбрионов
EBS 0,4 мл + 0,4 мл инактивированной сыворотки. Про-фильтровать через миллипоровые фильтры. Использовать по 100-500 мкл под маслом для культивиро¬вания эмбрионов, начиная со стадии пронуклеусов.
Приготовление сыворотки материнской крови
Ингредиент Процедура
Кровь 10-15 мл
Центрифугировать немедленно в настольной центрифуге 5-10 мин. при 1000 g. Воспользовавшись пастеровской пипеткой перенести плазму в стерильную пластиковую пробирку. Оставить пробирку с плазмой для свертывания. Убрать фибриновый сгусток. Инактивировать нагреванием в водяной бане при 560С в течение 30 мин. Профильтровать. Остаток можно заморозить.

Среды, в составе которых компоненты, необходимые для поддержания жизни, роста и развития сведены до минимума, относят к минимальным.
Среди биологических сред наибольшее распространение получила сы-воротка, т.к. она пригодна для культивирования клеток вне организма. Добавление 5 - 20% (по объему) сыворотки все еще остается необходимым для поддержания роста и развития клеток.
В питательной среде сыворотка выполняет следующие функции: служит буфером для лабильных и водонерастворимых питательных веществ; нейт-рализатором токсинов; поставщиком гормонов, пептидных факторов роста, незаменимых питательных низкомолекулярных веществ и, кроме того, сы-воротка обладает защитным эффектом.
В зависимости от назначения питательные среды также делят на четыре группы:
1) среды, используемые для культивирования гамет (среда Хэнкса, Тироде);
2) среды, используемые для оплодотворения гамет (среда Т6, ра¬створ Кребса-Рингера);
3) среды, используемые для культивирования эмб¬рионов (среда Виттена);
4) среды используемые для замораживания гамет и эмбрионов.
Основной режим питательной среды для культивирования гамет и эмб-рионов должен быть следующим.
1) осмотическое давление находится в пределах 280-290 мОсмоль/л. Если клетку содержать в среде с превышающим ее уровень осмотическим давлением -она будет сжиматься и сморщиваться, если же наоборот- клетка будет набухать и разрываться.
2) температура считается оптимальной в пределах 37-37,50С.
3) рН находится в пределах 7,2 (при культивировании) и 7,4 (при опло-дотворении).
4) наличие в воздухе 5% СС^, а в смеси - 5% кислорода, 90% азота, 5% углекислого газа (для этой цели среду необходимо эквилибрировать).
Состав-основных питательных сред

Компонент Среда, г/л
Т6 Виттена
РВ1
1 NaCl 5,719 4,140 8000
2 KCL 0,106 0,356 0,200
3 MgCl2H2O 0,096 - -
4 Na2HPO412 H2O 0,129 - 2,898
5 СаС122 H2O 0,262 - 0,132
6 КН2РО4 - 0,162 0,200
7 MgSO4H2O - 0,294 -
8 NaHCO3 2,101 -
Добавки (вводятся непосредственно перед работой)
Лантат натрия 2,791 6,235 -
Пируват натрия 0,052 0,036 0,036
Лактат кальция - 0,527 -
Глюкоза 1,0 1,0 1,0
БСА - 3,0 3,0
Стрептомицин 0,050 0,05 -
Пенициллин 0,060 0,075 0,060
Феноловый красный 0,010 - 0,010
Микроскоп. Устройство оптических приборов основано на законах преломления и отражения света, которые известны из курсов физики. На этом останавливаться здесь мы не будем и ограничимся только кратким описани¬ем частей микроскопа.
Оптическая система микроскопа, составляющая его основу, представ¬лена двумя системами линз:
а) объектив — обращен к объекту, дает изобра¬жение увеличенное, но обратное;
б) окуляр — обращен к глазу исследовате¬ля, увеличивает изображение, но делает его мнимым, оставляя обратным
Таким образом, в результате совместного действия обеих систем линз изображение получается увеличенное, обратное и мнимое. Объектив и оку¬ляр заключены в металлическую трубку — тубус, нормальная длина которого равна 160 мм. Современный микроскоп имеет несколько объективов с раз¬ным увеличением. Они закреплены в металлической оправе, называемой револьвером.
Помимо оптической системы, в микроскоп входят зеркало, предметный столик и осветитель. Зеркало помещается в нижней части штатива микроско¬па Оно служит для отражения лучей, падающих на него от источника света, в сторону исследуемого объекта. С одной стороны зеркало вогнутое, с другой -плоское. Для более интенсивного освещения пользуются вогнутым зеркалом. Предметный столик служит для помещения на нем исследуемого объек¬та. Через отверстие в середине столика проходит пучок лучей, отбрасывае¬мый зеркалом. Пройдя через объект, они попадают в объектив. Освещение можно регулировать увеличением или уменьшением отверстия в столике. Это достигается при помощи диафрагмы, которая укрепляется с нижней сто¬роны предметного столика
Осветитель — конденсор предназначен для усиления света Он состоит из линз, которые собирают лучи, отбрасываемые от зеркала, и концентри¬руют их на исследуемом предмете. Помещается конденсор между зеркалом и предметном столиком.
Замечательным орудием современного научного исследования, позволяющим более точно изучать строение живого вещества клеток и тканей, яв¬ляется электронный инвертированный микроскоп. Если оптический микроскоп позволяет получить увеличение исследуемого объекта в несколько ты¬сяч раз, то электронные инвертированные микроскопы могут давать увеличения в десятки — сотни тысяч раз. Принцип действия электронного микроскопа схож со световым микроскопом. В электронном микроскопе пучок световых лучей также направляется линзой конденсатора через образец, а полученное изображение уве¬личивается с помощью линз.
Таким образом, световые бинокулярные и электрические инвертированные микроскопы позволяют видеть живые клетки, а питательная среда — сохраняет жизнедеятельность репродуктивных клеток животных in vitro. Поэтому для кратковременного наблюдения за клетками их помещают в жидкую сре¬ду на предметное стекло или чашку Петри. При длительном наблюдении за клетками пользуются специальными камерами - это или плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или же плоские разборные ка¬меры. В качестве объектов можно использовать гаметы и эмбрионы живот¬ных, при этом их изучают в специально подобранных средах.
Наблюдения за гаметами и эмбрионами обычно регистрируются в виде фотографий, сделанных с помощью специальных фотонасадок к микроско¬пу. Живые клетки можно снимать и на видеокамеру.
Сравнение светового и электронного микроскопов
(показатели усреднены)
Показатель
Электронный микроскоп
Световой микроскоп
Источник излучения Электроны Свет
Длина волны 0,005 нм при 50 кВ 400-700 нм
Полезное максималь¬ное увеличение 250000 (на экране) х 150
Максимальное разрешение 0,5 им 200-500 нм
Линзы Электромагниты Стеклянные
Объект Не живой, обезвоженный относительно маленький или тонкий, удерживается на маленькой сетке в вакууме (трансмиссионный микроскоп).
Живой, который лежит в чашках Петри и предназначен для различных микроманипуляций (инвертированный микроскоп) Живой или неживой. Обычно лежит на предметном стекле.
Распространенные красители Содержат тяжелые метал¬лы, которые отражают электроны (трансмиссионный микроскоп) Цветные красители
Изображение Обычно черно-белое Обычно цветное
В ряде случаев такая микрокиносъемка дает очень важную информацию. Применяя ускоренную или замедленную киносъемку, можно видеть протекание таких важных процессов, как деление клеток, фагоцитоз, течение цитоплазмы, слияние кле¬ток, т.е. оплодотворение и т.д. В настоящее время широко практикуется кон¬струкция, состоящая из микроскопа и компьютера, при программном обес¬печении которого исследователь получает полную информацию от любого биологического объекта.
Особенности витального метода изучения репродуктивных клеток в биотехнологии следующие:
1. Возможность проведения фундаментальных исследований с целью изучения таких биологически неповторимых и уникальных процессов как разви¬тие гамет и их оплодотворение, развитие предимплантационных.....



Полную версию материала можете скачать через 30 секунд !!!

Автор: almira777 | 8 |


Загрузка...

RU / Сборник курсовых работ [бесплатно], скачать бесплатно Витальный метод изучения половых клеток животных курсовую работу, база готовых курсовых работ бесплатно, готовые курсовые работы Витальный метод изучения половых клеток животных скачать бесплатно, курсовая работа биотехнология скачать бесплатно, скачать бесплатно Витальный метод изучения половых клеток животных курсовую работу база готовых курсовых работ бесплатно готовые курсовые работы Витальный метод изучения половых клеток животных скачать бесплатно курсовая работа биотехнология ска, Курсовая работа: Витальный метод изучения половых клеток животных